INTRODUCCIÓN
La
bioimpresión tridimensional (3D) se ha convertido en un método versátil y
poderoso para generar una variedad de construcciones biológicas, incluidos
andamios de matriz extracelular o ósea, tejido epitelial, tumoral o muscular,
así como organoides (Zhao et al., 2014; Fahmy et al., 2016; Carter et al.,
2017; Mir y Nakamura, 2017; Hong et al., 2018). Debido a su tremendo potencial
para una gran variedad de campos de investigación, incluida la detección de
toxicidad o drogas in vitro sin animales, la bioimpresión 3D está siendo
aspirada cada vez más por disciplinas además de sus dominios típicos de
ingeniería de tejidos y medicina regenerativa.
Sin
embargo, la bioimpresión 3D requiere una infraestructura específica que en su
mayoría es costosa, lo que ralentiza su integración con otras disciplinas. Los
costes de la tecnología de bioimpresión 3D convencional y disponible en el
mercado oscilan entre decenas de miles y varios cientos de miles de euros, lo
que limita en gran medida su aplicabilidad a un pequeño número de laboratorios
especializados. Por lo tanto, a pesar de ser una tecnología de punta que es
relevante para una amplia comunidad, no es fácilmente aplicable para la
investigación en entornos de bajos recursos o incluso con fines educativos, por
ejemplo, en escuelas primarias o secundarias o universidades. Además, las
bioimpresoras 3D comunes suelen ser complicadas de usar y requieren personal
altamente calificado para su aplicación y mantenimiento.
A
pesar de este hecho, muchos sistemas están restringidos a generar andamios muy
simples, por ejemplo, bidimensionales únicamente. Como el hardware y el
software son en su mayoría de código cerrado, se evita la modificación o
personalización para la generación de estructuras más complejas. Además, los
dispositivos disponibles en el mercado suelen ser voluminosos e inmóviles y
solo permiten su funcionamiento en condiciones no estériles o semiestériles, lo
que, en el peor de los casos, puede causar el fracaso de un experimento
planificado. Por lo tanto, a pesar de su gran potencial, la metodología
obviamente aún está poco adoptada y mucho menos explotada de lo que podría ser,
como si la tecnología requerida estuviera disponible para una gama más amplia
de laboratorios.
La
aparición de tecnologías de creación rápida de prototipos, incluida la
arquitectura de microcontroladores de código abierto, piezas electrónicas,
mecánicas y robóticas de bajo precio, así como técnicas de fabricación aditiva
de grado de consumo, como la impresión 3D de escritorio, está revolucionando
actualmente el carácter de la infraestructura de automatización de laboratorios
científicos a lo largo de toda la investigación. disciplinas de las ciencias de
la vida (Delalat et al., 2017; Shukla et al., 2017; Schmitt et al., 2019). La
tecnología de creación rápida de prototipos, también a la que aspira el llamado
movimiento Maker, una cultura de generación de productos de bricolaje (Landrain
et al., 2013; Seyfried et al., 2014), hace posible rápida y fácilmente diseñar
dispositivos fáciles de usar de complejidad reducida y de costo ultra bajo.
Para
abordar las limitaciones de la tecnología convencional y disponible
comercialmente descrita anteriormente, nuestro objetivo fue desarrollar una
bioimpresora 3D basada en un enfoque de Makers, que se puede instalar en un
solo día, tiene un tamaño práctico para caber en una campana de flujo laminar
estándar, personalizable, costo ultra bajo y, por lo tanto, asequible para una
amplia gama de laboratorios de investigación e instituciones educativas. Con
este fin el objetivo es modificar una impresora 3D de escritorio lista para
usar para llevar una jeringa estéril y desechable de 1 mililitro para la
impresión de hidrogeles.
Para
demostrar la aplicabilidad de nuestro dispositivo a la investigación biomédica
para la impresión bidimensional y tridimensional, teníamos la intención de
realizar un estudio de caso con diferentes tipos de hidrogeles a base de
alginato cargados de células de mamíferos y libres de células. Para la
evaluación de la viabilidad celular en bioconstrucciones cargadas de células
durante períodos prolongados, nuestro objetivo fue analizar la proliferación
celular mediante microscopía de fluorescencia.
Se
decide usar hidrogel a base de alginato debido a su biocompatibilidad y
propiedades de gelificación que lo hacen útil para la bioimpresión (Wang et
al., 2003; Abbah et al., 2008; Hunt et al., 2009; Ab-Rahim et al., 2013). ;
Hunt y Grover, 2013; Sarker et al., 2014; Tabriz et al., 2015). Para el caso de
estudio fue utilizar células recombinantes, que expresan de manera estable la
proteína fluorescente amarilla como sistema modelo.
La
línea celular permite la evaluación microscópica y el análisis cuantitativo de
la proliferación y viabilidad celular en fluomicrografías obtenidas a partir de
imágenes de alto contenido de hidrogeles cargados de células y, por lo tanto,
el análisis de construcciones biofabricadas generadas utilizando la
bioimpresora 3D de ultra bajo costo construida internamente. (Schneidereit et
al., 2016; Kuenzel et al., 2017; Milanos et al., 2018).
MATERIAL Y
MÉTODOS
Como punto de partida para desarrollar una bioimpresora 3D de costo
ultra bajo, el objetivo es seleccionar un modelo básico de impresora 3D de
escritorio que fuera eficiente en recursos y de alta precisión y, al mismo
tiempo, ampliamente respaldado por una amplia comunidad de usuarios con
respecto a aplicación y resolución de problemas. Teniendo en cuenta los
aspectos antes mencionados, se decidió adquirir un kit de bricolaje Anet A8
Desktop 3D Printer Prusa i3 (ver figura 1) y ensamblarlo en unas pocas horas en
función de la gran variedad de tutoriales.
Figura 1. Impresión en 3D
En el próximo paso, para la conversión de la impresora 3D original
en una bioimpresora 3D de escritorio, hay que fabricar una unidad de jeringa
imprimible en 3D para el manejo de biotintas o hidrogeles cargados de células.
Con este fin, se diseña una unidad de jeringa adecuada para transportar y
operar una jeringa desechable utilizando el software CAD (Autodesk Inventor).
Se implementó este tipo de jeringa en nuestro sistema por las siguientes
razones. - La jeringa es estéril y está fabricada para uso médico, por lo que
es adecuada para su aplicación con cultivos celulares in vitro. - El émbolo de
la jeringa está equipado con una columna cónica para reducir el volumen muerto,
lo que facilita la aplicabilidad y acorta el tiempo de espera experimental
antes de la biofabricación. - La punta de la jeringa consta de un accesorio
versátil para la conexión con varios tipos de agujas compatibles que pueden
seleccionarse según la línea celular o la biotinta que se vaya a usar y/o la
construcción que se vaya a fabricar.
Las dimensiones generales de la jeringa permiten la integración con
la impresora 3D de escritorio preseleccionada y quinto, el volumen de la
jeringa es adecuado para imprimir monocapas bidimensionales de área extendida o
grandes construcciones tridimensionales, por ejemplo, en forma de cubo, con una
longitud lateral de 10 mm.
Figura 2. Implementación de la jeringa
Para que la conversión de la impresora 3D original en una
bioimpresora 3D sea simple, directa y rentable, se utilizaron componentes
existentes de la configuración original como la parte de circuitos electrónicos
visualizada en la figura 3. La unidad está formada por un total de 48
componentes, incluidos tornillos y tuercas, de los cuales, en nuestro caso, 15
se imprimieron en 3D con acrilonitrilo butadieno estireno negro, pero que
también podrían fabricarse utilizando cualquier otra técnica de fabricación de
material diferente La impresión de las piezas tomó alrededor de 8 horas. Además
de las piezas impresas en 3D, la unidad está compuesta por una varilla roscada
de 4 mm, unida al motor paso a paso de la impresora 3D original a través de un
acoplamiento de resorte.
Figura 3. Circuito eléctrico de la impresora 3D
La usabilidad de una bioimpresora 3D para la biofabricación está
limitada por una variedad de parámetros, incluidos su rango y velocidad de
desplazamiento general, la tasa de extrusión, su resolución espacial, es decir,
la distancia de desplazamiento más pequeña del sistema en X, Y y Z. Su dirección
y su precisión tiene una diferencia entre el resultado de impresión real y el
resultado esperado basado en un modelo CAD proporcionado y cuantificado por una
técnica de medición. El rango de desplazamiento de la impresora 3D en su
configuración original es de 220 × 220 × 240 mm (eje X-Y-Z). Sin embargo, en el
sistema modificado, el rango de recorrido general se reduce a 100 × 100 × 240
mm (eje X-Y-Z) a medida que la unidad de jeringa se desplaza hacia el centro de
la cama de impresión con respecto al origen de impresión en la impresora 3D
original. Según la información proporcionada por el fabricante, la resolución
espacial, es decir, la precisión de posicionamiento en las direcciones X-Y y Z,
es de 12 y 4 μm, respectivamente.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Para superar las limitaciones de la tecnología disponible
comercialmente adecuada para la bioimpresión 3D, se desarrolló una bioimpresora
3D que es ventajosa por varias razones. En primer lugar, con un tamaño de 400 ×
415 mm y un peso de 8,5 kilogramos, el sistema es más pequeño y ligero en
comparación con la tecnología convencional, por ejemplo, con la impresora
alemana “BioScaffolder 2.1” y, por lo tanto, es adecuado para funcionar en un
entorno estéril, como una campana de flujo laminar estándar. Además, debido a
las características antes mencionadas, el sistema es portátil y adecuado, por
ejemplo, para operación compartida en diferentes laboratorios.
En segundo lugar, con costos de aproximadamente $ 400, el sistema es
de costo relativamente bajo y es fácilmente aplicable a una amplia gama de
laboratorios en varios campos de investigación y también a instituciones
educativas. En tercer lugar, el dispositivo se construyó sobre la base de un
enfoque Makers, es decir, mediante el uso de componentes estándar e impresión
de escritorio convencionales 3D, y las personas podían reconstruirlo o
modificarlo fácilmente, por ejemplo, en los llamados fab labs (laboratorios de
fabricación).
En cuarto lugar, el concepto empleado de "generación
automática", es decir, el uso de una impresora 3D estándar para la
fabricación de piezas que se utilizarán para la modificación y generación de un
sistema derivado con una función diferente, también puede ser aplicable a otros
tipos. de impresoras 3D. Además, como el dispositivo se puede volver a
convertir fácilmente a su configuración original, se puede utilizar para la
fabricación de piezas de repuesto, es decir, para el "servicio
automático", así como para modificaciones y personalizaciones adicionales.
Esta novedad también es una razón por la cual la impresora probablemente sea la
bioimpresora 3D más eficiente en recursos reportada en la literatura. Dado que
el sistema de impresión original representa más del 95 % de los costos
generales, los sistemas futuros que se basen en nuestro concepto pueden ser
incluso más económicos porque los costos de los sistemas de impresión 3D de
escritorio actualmente están disminuyendo mientras que su disponibilidad
general aumenta. En quinto lugar, la impresora en su configuración actual es
fácil de usar, sencilla y no requiere personal altamente calificado para su
aplicación y mantenimiento, lo que destaca aún más la aplicabilidad en el campo
académico y educativo. Para a preparación de la impresión 3D es necesario
revisar el funcionamiento de la placa de control, su correcto cableado del
equipo como se muestra en la siguiente figura.
Figura 4. Preparación de la impresora 3D
La impresora de bajo costo está equipada con una jeringa desechable
de 1 ml que es rentable y, por lo tanto, respalda el concepto de bajo costo del
sistema general. Además, el conector de la jeringa permite la operación con
diferentes tipos de agujas y brinda versatilidad experimental. Sin embargo,
debido al hecho de que las jeringas y las agujas no están fabricadas para su uso
en aplicaciones de alta precisión, tanto las jeringas como las agujas varían en
sus longitudes. Por lo tanto, el sistema en la configuración actual requiere la
calibración de la distancia entre la aguja y el lecho de impresión cada vez que
se reemplaza la jeringa y/o la aguja, lo que da como resultado un tiempo de
preparación de varios minutos al montar la jeringa en la unidad.
Figura 5. Implementación de la jeringa.
A pesar de las ventajas mencionadas anteriormente sobre los
dispositivos convencionales, el sistema presentado también tiene potencial de
mejora. Al evaluar las características de impresión de la bioimpresora 3D de
costo bajo, se logró observar una alta repetibilidad con respecto al hidrogel
que se utilizó de gelatina al 5 % de alginato con 5 % de viscosidad, pero una
desviación bastante grande de las estructuras impresas de las dimensiones
objetivo que probablemente se deba a las siguientes razones.
En primer lugar, la unidad de jeringa está fabricada con ABS
flexible y, por lo tanto, es propensa a deformarse durante el funcionamiento.
En segundo lugar, la varilla roscada y las tuercas conectadas son de calidad de
almacén, lo que hace que los componentes se deslicen y produzcan una presión
variable aplicada al hidrogel. Además, el acoplamiento de resorte utilizado
para conectar la varilla roscada con el motor paso a paso contribuye a obtener
resultados inconsistentes debido a la conformidad impredecible del acoplamiento
mecánico. En tercer lugar, la jeringa y el émbolo están hechos de plástico que
es propenso a deformarse durante la extrusión del hidrogel, lo que afecta
fuertemente la presión aplicada al hidrogel y, por lo tanto, la cantidad de
material extruido. Los problemas antes mencionados se pueden abordar utilizando
un vidrio, por ejemplo, una jeringa especial denominada “Hamilton”, y
construyendo la unidad con aluminio y componentes de mayor precisión, incluido
un husillo roscado con tornillo de avance, centrado terminalmente mediante
rodamientos de bolas. Se ha informado que la longitud de la aguja afecta la
viabilidad celular, con una viabilidad celular cada vez más afectada junto con
el aumento de la longitud de la aguja (Faulkner-Jones et al., 2015).
Con la aplicación de agujas más cortas puede aumentar la aptitud
celular y, con ello, disminuir la variabilidad del dispositivo y los resultados
de impresión. Además, la forma de la aguja se puede modificar a una aguja de
forma cónica en lugar de la de forma cilíndrica que usamos, lo que podría
reducir el estrés mecánico de las células extruidas, aumentando la viabilidad
celular (Reid et al., 2016) en las construcciones impresas y, con ello, la
confiabilidad general del sistema. A pesar de que las modificaciones antes
mencionadas darían como resultado inevitablemente una bioimpresora 3D de mayor
precisión, también aumentaría drásticamente los costos y el tiempo requerido
para su instalación. Por lo tanto, el sistema presentado proporciona un equilibrio
inteligente entre rendimiento y costes. Es importante mencionar que se
requieren más pruebas con diferentes materiales para que la impresora
modificada sea más aplicable. En consecuencia, esto también desafiará los
problemas de resolución encontrados y mencionados anteriormente.
Figura 6. Implementación de varios componentes
CONCLUSIONES
Se describe la conversión de una impresora 3D
comercial en una bioimpresora 3D, lo que proporciona un punto de partida para
un concepto intercambiable para que la comunidad lo modifique y optimice aún
más para adaptarse a los requisitos específicos de una pregunta individual en
la investigación biomédica. Esta es la primera vez que se describe un sistema
de bioimpresión 3D, que tiene un costo relativamente bajo y, por lo tanto, está
disponible para una amplia comunidad, en gran parte de "generación
automática" y "servicio automático", por lo tanto, eficiente en
recursos, portátil para, por ejemplo, uso compartido y personalizable a través
de archivos de diseño (STEP) e impresión (STL) provistos.
Dado que la unidad de jeringa se construyó en
base a un enfoque de Makers y una modificación mediante el uso de un software
CAD, adicional se puede implementar otra tecnología de biosensores para
satisfacer los requisitos de una amplia variedad de campos de investigación,
incluidas las ciencias de la vida e incluso de los materiales. En general la
plataforma de bioimpresión 3D de costo ultra bajo presentada en este artículo
mejora las tecnologías clásicas en términos de portabilidad, costo y
personalización y brinda un ejemplo de tecnología de biofabricación de bajo
costo que es compatible con la optimización de prototipos rápida y eficiente en
recursos. En conjunto, este trabajo contribuye a expandir la aplicabilidad y
disponibilidad de dispositivos de bioimpresión 3D comercialmente viables para
su uso en investigación y/o educación biomédica.
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