Artículo científico: Extracción Hidroalcohólica de Polifenoles a partir de las hojas de Cedrón (Aloysia Citrodorae
Paláu), como ingrediente alimentario natural
Publicación Semestral. Vol. 1, No. 2, julio-diciembre 2022, Ecuador (p. 56-69)
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EXTRACCIÓN HIDROALCOHÓLICA DE POLIFENOLES A PARTIR DE LAS
HOJAS DE CEDRÓN (Aloysia citrodorae Paláu), COMO INGREDIENTE
ALIMENTARIO NATURAL
Jaime Orlando Rojas Molina*
1
, Ana Maricela Trávez Castellano1, Edwin Ramiro Cevallos
Carvajal1, Natali Manuela Maldonado Toapanta1
1Universidad Técnica de Cotopaxi, Facultad de Ciencias Agropecuarias y Recursos Naturales, Ingeniería
Ambiental, Latacunga, Cotopaxi, Ecuador.
*Dirección para correspondencia: jaime.rojas@utc.edu.ec
Fecha de Recepción: 10-05-2022 Fecha de Aceptación: 15-06-2022 Fecha de Publicación: 31-07-2022
Resumen
La planta de cedrón (Aloysia citrodorae Paláu) es un arbusto aromático, cuyas infusiones de hojas y tallos son
utilizadas en la medicina ancestral para tratamientos de cólicos, diarrea, indigestión, náuseas, ansiedad, insomnio
fiebre y resfriados. Por lo que sus extractos pueden ser utilizados por la industria alimentaria, cosmética y
farmacéutica como ingrediente natural de sus productos. Esta investigación tuvo como objetivo identificar
compuestos bioactivos de las hojas de cedrón, mediante la metodología del tamizaje fitoquímico. Además, de
optimizar el proceso de extracción hidroalcohólica de los compuestos químicos presentes en este material vegetal.
Para la optimización numérica se empleó un diseño de superficie respuesta IV Óptimo. Los ensayos cualitativos
detectaron una mayor presencia de compuestos fenólicos y flavonoides en los extractos acuoso y alcohólico.
Además, se encontró en menor cantidad azúcares reductores, principios amargos, compuestos grasos y triterpenos.
El modelo matemático, sugiere que las condiciones óptimas de extracción son de 90 % (v/v) de etanol, 24 horas
como tiempo de extracción y 60 °C de temperatura de extracción. Para comprobar el proceso se replicó el
experimento obteniendo un contenido de polifenoles totales de 102.13 mg/g y capacidad antioxidante 917.23 µM
Fe 2+/g, similares a los obtenidos mediante el método de optimización numérica. Cabe mencionar que el extracto
hidroalcohólico tiene una alta capacidad antioxidante y contenido de polifenoles, por lo que puede ser utilizado
como un ingrediente natural, para eliminar los radicales libres presentes en los alimentos.
Palabras claves: Aloysia citrodorae Paláu, extracción hidroalcohólica, polifenoles totales, capacidad
antioxidante.
IDs Orcid:
Jaime Orlando Rojas Molina: https://orcid.org/0000-0001-5830-796X
Ana Maricela Trávez Castellano: https://orcid.org/0000-0001-8962-8897
Edwin Ramiro Cevallos Carvajal: https://orcid.org/0000-0001-7773-860X
Natali Manuela Maldonado Toapanta: https://orcid.org/0000-0003-0374-2344
Rojas J., Trávez, A., Cevallos E., Maldonado N.
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.
HYDROALOCHOLIC EXTRACTION OF POLYPHENOLS FROM CEDRON
LEAVES (Aloysia citrodorae Paláu), AS A NATURAL FOOD INGREDIENT
Abstract
The cedron plant (Aloysia citrodorae Paláu) is an aromatic shrub, whose infusions of leaves and stems are used
in ancestral medicine for treatments of colic, diarrhea, indigestion, nausea, anxiety, insomnia, fever and colds. So
its extracts can be used by the food, cosmetic and pharmaceutical industry as a natural ingredient in their products.
This research aimed to identify bioactive compounds of cedar leaves, using the methodology of phytochemical
screening. In addition, to optimize the process of hydroalcoholic extraction of the chemical compounds present in
this plant material. For numerical optimization, an Optimal IV response surface design was used. Qualitative
assays detected an increased presence of phenolic compounds and flavonoids in aqueous and alcoholic extracts.
In addition, reducing sugars, bitter principles, fatty compounds and triterpenes were found in smaller quantities.
The mathematical model suggests that the optimal extraction conditions are 90% (v/v) of ethanol, 24 hours as
extraction time and 60 °C of extraction temperature. To test the process, the experiment was replicated obtaining
a total polyphenol content of 102.13 mg/g and antioxidant capacity 917.23 μM Fe 2+/g, similar to those obtained
by the numerical optimization method. It is worth mentioning that the hydroalcoholic extract has a high
antioxidant capacity and polyphenol content, so it can be used as a natural ingredient, to eliminate free radicals
present in food.
Keywords: Aloysia citrodorae Palau, hydroalcoholic extraction, total polyphenols, antioxidant capacity.
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1. INTRODUCCIÓN
La Aloysia citrodorae Paláu conocida como cedrón, es un arbusto aromático, muy utilizado en
el Ecuador por su agradable olor y sabor, además, por su utilización en la industria
farmacéutica, cosmética y alimentaria (Carnat et al., 1999). Esta planta es conocida por sus
efectos antipasmódicos, antioxidantes, sedantes, antivirales, antibacterianas, antipalúdicas,
antigenotóxicas y citostáticos (Ricco et al., 2011; Thormar, 2010; Bahramsoltani et al., 2010).
De esta planta aromática se pueden extraer líquidos fragantes (aceite esencial), cuya
composición química es muy diversa, donde se destaca el citral, (-)-limoneno, (-)-carvona,
linalol, geraniol y pineno (Thormar, 2010). Pero la planta también posee varios compuestos
secundarios en sus infusiones como: fenoles totales, taninos totales, flavonoides hidroxiladas
y ácidos hidroxicinámicos que tienen propiedades antioxidantes (Ricco, 2011; Bahramsoltani
et al., 2010). La variación de la concentración de compuestos bioactivos en planta varía en
función a factores genéticos, ontogénicos, bióticos y abióticos (Álvarez-Rosales et al., 2019).
Mediante el contacto del material vegetal con disolventes orgánicos e inorgánicos, se puede
extraer los principios activos presentes en las plantas, que los solubilizan y forman mezclas
complejas (extractos) (Álvarez-Rosales et al., 2019). Para obtener procesos eficientes de
extracciones se pueden considerar los siguientes factores: características del material vegetal,
tamaño de partícula, tipo de disolvente, temperatura de extracción, agitación, relación masa-
disolvente y tiempo de extracción (Álvarez-Rosales et al., 2019; Veléz, 2015). A condiciones
de temperatura de 60 ºC y 24 horas de extracción, se observó la mayor actividad antioxidante
y contenido de polifenoles en muestras vegetales, por lo que la temperatura y el tiempo son
factores que determinan la extracción de los compuestos responsables de la actividad
antioxidante (Gavilánez, 2020).
Los estudios realizados a extractos vegetales ha permitido emplearlos en calidad de
antioxidantes, antimicrobianos, aromatizantes, saborizantes, colorantes, energizantes y
enriquecedores del alimento con activos naturales propios de la planta (Pérez, 2018).
En los últimos años el daño oxidativo se ha detectado en enfermedades como el cáncer, la
diabetes y el Alzheimer, entre otras. Como una alternativa para la prevención y tratamiento de
Rojas J., Trávez, A., Cevallos E., Maldonado N.
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tales enfermedades, se ha propuesto el consumo de antioxidantes, especialmente de fuentes
vegetales (Pérez-Jaramillo et al., 2017).
La tendencia a nivel mundial, es la utilización de principios activos de plantas como
ingredientes naturales en los procesos alimentarios, debido a sus propiedades antioxidantes,
antimicrobianas, colorantes, aromatizantes, saborizantes y energizantes (Chamorro, 2020).
Este trabajo de investigación determina el perfil fitoquímico del cedrón (Aloysia citrodorae
Paláu) y optimiza el proceso de extracción hidroalcohólica de los compuestos bioactivos del
cedrón en función al contenido de polifenoles y capacidad antioxidante.
2. METODOLOGÍA
2.1 Recolección y secado del material vegetal
Se recolectó la planta de cedrón antes de la etapa de floración, luego se escogió las hojas libres
de alteraciones morfológicas y enfermedades, posteriormente, se secó en una estufa a 40 °C
hasta lograr una humedad menor al 5% m/m. A continuación, se trituró el material vegetal con
un molino de cuchillas de alta velocidad (15 000 min-1.15 s), hasta obtener un polvo fino
(Gaibor et al., 2017).
2.2 Determinación del perfil fitoquímico de hojas de cedrón (Aloysia citrodorae Paláu)
Se determinó el perfil fitoquímico en el material vegetal seco, para lo cual se realizó
extracciones en tres diferentes disolventes: alcohol etílico (80% v/v), éter de petróleo y agua
destilada y se siguió la metodología planteada por Miranda y Cuéllar (2000).
2.3 Optimización del proceso de extracción hidroalcohólico de las hojas de cedrón
La optimización del proceso de extracción hidroalcohólico de los compuestos bioactivos del
cedrón, se ejecutó mediante maceración del material vegetal en una relación 1:10
(masa/disolvente), para el diseño experimental y procesamiento de la información se utilizó el
programa Design Expert 8.0.6 (Stat-Ease Inc., Minneapolis, EE.UU.), esperando que el
extracto hidroalcohólico de cedrón obtuviera mayor cantidad de polifenoles totales y capacidad
antioxidante reductor del hierro. Para la optimización numérica se empleó un diseño de
superficie de respuesta IV Óptimo, el cual generó un modelo matemático que describe el
comportamiento de las variables de respuesta (contenido de polifenoles totales y capacidad
antioxidante reductora de hierro).
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Los factores evaluados fueron la concentración de etanol (A), tiempo de extracción (B) y
temperatura (C). La Tabla 1, muestra las condiciones experimentales seleccionadas para el
diseño de experimentos, donde se describen los mínimos y máximos de los factores.
Tabla 1. Condiciones experimentales seleccionadas para el diseño de experimentos
Factor
Nomenclatura
Unidad
Tipo
Subtipo
Mínimo
Máximo
Concentración
de etanol
A
%
Numérica
Discreta
60
90
Tiempo de
extracción
B
horas
Numérica
Discreta
6
24
Temperatura
C
°C
Numérica
Discreta
30
60
Fuente: Maldonado y Reinoso, 2021
Los datos obtenidos del diseño de superficie respuesta son reportados en la matriz
experimental presentada en la Tabla 2.
La matriz del diseño experimental (Tabla 2), indica un total de 23 corridas experimentales,
entre las que se incluyen cinco réplicas. Estas combinaciones fueron simuladas en los
experimentos de laboratorio, donde el contenido de polifenoles totales y capacidad antioxidante
reductor del hierro fueron las variables de respuesta.
Con el programa Design Expert 8.0.6 se procesó la información, donde se escogió una de las
soluciones sugeridas por el modelo matemático, la cual obtuvo una mayor deseabilidad a las
condiciones de extracción optimizadas. Para validar la optimización se replicó el experimento
a las condiciones optimizadas por el programa y se comparó con los valores predichos
generados de la optimización, las variables a evaluar fueron el contenido de polifenoles y la
capacidad antioxidante reductora del hierro.
Rojas J., Trávez, A., Cevallos E., Maldonado N.
61
Tabla 2. Matriz del diseño experimental
Corridas
Etanol
(%)
Tiempo
(h)
Temperatura
(ºC)
1
60
24
30
2
60
6
60
3
60
6
30
4
75
24
60
5
90
6
30
6
60
15
60
7
90
15
30
8
90
15
30
9
75
24
30
10
75
6
30
11
75
15
60
12
75
6
60
13
90
24
30
14
60
24
60
15
60
15
30
16
90
15
60
17
90
15
60
18
90
24
60
19
90
6
60
20
75
24
60
21
75
24
30
22
75
15
30
23
60
6
30
Fuente: Maldonado y Reinoso, 2021
2.4 Determinación de la capacidad antioxidante reductora del hierro
La metodología de evaluación de la actividad antioxidante de extractos de plantas, se
fundamenta en determinar la capacidad que tienen los compuestos fitoquímicos para reducir el
hierro férrico a ferroso. Mediante disoluciones ácidas se crea un medio para la reacción del
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complejo Fe3+-TPTZ, este complejo reacciona con sustancias reductoras produciendo Fe2+-
TPTZ, este compuesto posee una coloración azul oscura, que tiene una absorción máxima de
radiación a 593 nm y puede ser empleada por la metodología de espectrofotometría (Texeira et
al., 2013).
Para la preparación del reactivo FRAP, se pesó 0,0078 g de TPTZ [2,4,6-tri (2-piridil)-1,3,5-
triazina], a este se le añade 1 mL de HCl (1:1), luego, se coloca 2,5 mL de HCl 40 mM y se
agita hasta disolver completamente. Posteriormente, se adicionó 25 mL de buffer acetato y 2,5
mL de disolución 20 mM de FeCl3, esta mezcla se incubó a 37 °C por 15 minutos.
En tubos de ensayo de 10 mL, se colocó 50 µL del extracto de la muestra y de los estándares
de la curva de calibración. Luego, se añadió 1.5 mL del reactivo FRAP. Se dejó reposar a 37°C
durante 30 minutos. Posteriormente, con un espectrofotómetro se midió la absorbancia a 593
nm (Nanasombat y Wimuttigosol, 2011). Para la curva de calibración de Fe2+ se empleó una
sal de Mohr [Fe(NH4)2SO4] como patrón primario. Los resultados se expresaron como µ mol
Fe2+ /g (Texeira et al., 2013; Nanasombat y Wimuttigosol, 2011).
2.5 Determinación de polifenoles totales
Para la cuantificación de polifenoles totales se empleó el reactivo de Folin-Ciocalteu. Los
compuestos fenólicos reaccionan con este reactivo en medio básico, dando una coloración azul
intensa que tiene una máxima absorción a los 764 nm. Para preparar la muestra se pesó 1 g del
material vegetal y se le colocó 10 mL del disolvente, luego, se homogenizó y centrifugó (MLW
modelo T 52, Alemania) durante 10 minutos a 3500 min-1. Se tomó 1 mL del sobrenadante y
se diluyó hasta que ingrese en la curva de calibración para la cuantificación. En tubos de ensayo
de 10 mL se colocó 50 µL de la muestra y de los estándares de la curva de calibración, luego,
se adicionó 2.5 mL de disolución acuosa de Folin-Ciocalteu. La disolución se agitó y se dejó
en reposo durante 5 minutos, posteriormente se añadió 2 mL de una disolución al 7.5% (m/v)
de Na2CO3, se agitó hasta alcanzar una mezcla homogénea, se dejó reposar durante 2 horas y
se leyó la absorbancia a 765 nm. Para la elaboración de la curva de calibración se utilizó ácido
gálico como patrón. Los resultados se expresaron en miligramos de ácido gálico /100 g de
muestra (Singleton et al., 1999).
Rojas J., Trávez, A., Cevallos E., Maldonado N.
63
2.6 Caracterización del extracto hidroalcohólico optimizado
La caracterización del extracto hidroalcohólico optimizado de cedrón, se lo realizó en función
a la capacidad antioxidante reductora de hierro, contenido de polifenoles totales, sólidos
solubles refractométricos (NTE INEN-ISO 2173, 2013), determinación de sólidos totales por
gravimetría (AOAC 925.105/90., 2010), pH (NTE INEN-ISO 1842, 2013), acidez valorable
(NTE INEN-ISO 750, 2013) y turbidez (NTE INEN-ISO 7027, 2013).
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1 Perfil fitoquímico de hojas de cedrón (Aloysia citrodorae Paláu)
Mediante pruebas cualitativas, se detectaron la presencia o ausencia de metabolitos secundarios
en las hojas de cedrón. La Tabla 3, muestra la presencia de compuestos fenólicos y flavonoides
en los extractos acuoso y alcohólico, por lo que es viable la extracción con estos disolventes.
Vélez et al. (2019), manifiesta que los compuestos flavonoides e hidroxiladas son solubles en
disolventes acuosos, alcohólicos e hidroalcohólicos. Además, se encontró azúcares reductores,
principios amargos, compuestos grasos y triterpenos. En menor cantidad se halló alcaloides y
grupos lactónicos.
Tabla 3. Perfil fitoquímico del cedrón (Aloysia citrodora paláu)
Metabolito
Ensayo
Extracto
Etéreo
Extracto
Etanólico
Extracto
Acuoso
Compuestos grasos
Sudan
+++
Alcaloides
Drangendorff
+-
+
-
Agrupamiento lactónico
Baljet
+-
+-
Triterpenos / esteroides
Lieberman B.
+++
+++
Catequinas
Catequinas
+++
Resinas
Resinas
-
Azúcares reductores
Fehling
-
+++
Saponina
Espuma
+++
+++
Compuestos fenólicos
Cloruro férrico
(III)
+++
+++
Aminoácidos libres/ aminas
Nihidrina
-
Quinonas/ benzoquinonas
Bortranger
+++
Flavonoides
Shinoda
+++
+++
Glucósidos cardiotónicos
Kedde
-
Mucilagos
Mucilagos
+++
Principios amargos
Principios
amargos
+++
+: Presencia +-: Regular -: Ausencia
Fuente: Maldonado y Reinoso, 2021
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3.2 Optimización del proceso de extracción hidroalcohólico de las hojas de cedrón
La Tabla 4, muestra los modelos codificados de las variables respuesta contenido de polifenoles
totales y capacidad antioxidante reductor de hierro.
Para el modelo matemático de la variable dependiente de contenido de polifenoles totales, se
observa que se adaptó a un modelo lineal, resultó significativo con un nivel de confianza del
95,0%, mostrando que existió una relación estadísticamente significativa a los factores de
concentración de etanol (A), tiempo de extracción (B) y temperatura de extracción (C). El R2
indicó que el modelo ajustado explica el 98.97% de la variabilidad del contenido de polifenoles.
Tabla 4. Parámetros de los modelos codificados de contenido de polifenoles totales y la
capacidad antioxidante reductor del hierro
Indicador
Contenido Polifenoles
totales (mg/g)
Capacidad antioxidante
reductor del hierro (µM
Fe 2+/g muestra)
Intercepto
80.97
806.51*
A
16.09*
102.32*
B
C
AB
AC
BC
A2
B2
2.00*
1.18*
-
-
-
-
-
17.49*
24.92*
0.41
-10.46*
0.65
-25.52*
0.61
R2
R2 ajustado
R2 predicho
0.9911
0.9897
0.9860
0.9862
0.9782
0.9543
F modelo
708.06*
124.65
F falta de ajuste
Precisión adecuada
6.35
69.26
1.03
33.35
Rojas J., Trávez, A., Cevallos E., Maldonado N.
65
Nota: A: concentración de etanol; B: tiempo de extracción; C: temperatura de
extracción. *Valor significativo para p ≤ 0,05. Fuente: Maldonado y Reinoso, 2021
Para el modelo matemático de la variable dependiente de contenido de polifenoles totales, se
observa que se adaptó a un modelo lineal, resultó significativo con un nivel de confianza del
95.0%, mostrando que existió una relación estadísticamente significativa a los factores de
concentración de etanol (A), tiempo de extracción (B) y temperatura de extracción (C). El R2
indicó que el modelo ajustado explica el 98.97 % de la variabilidad del contenido de
polifenoles.
En función a los coeficientes, se observa que el término concentración de etanol (16.09) y
temperatura de extracción (2.00) tuvieron mayor influencia sobre el modelo de contenido de
polifenoles, seguido del tiempo de extracción (1.18). En la Tabla 4, se observa el signo positivo
de los coeficientes, lo que quiere decir que el contenido de polifenoles totales aumenta a medida
que aumenta la concentración de etanol (A), tiempo de extracción (B) y temperatura de
extracción (C), y viceversa. La influencia de estos factores sobre el contenido de polifenoles
totales se observa en la figura 1.
Figura 1 Influencia de la concentración de etanol (A), tiempo de extracción (B) y
temperatura de extracción (C) en el contenido de polifenoles totales (mg/g) del extracto
hidroalcohólico de cedrón.
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Para el modelo matemático de la variable dependiente capacidad antioxidante reductora del
hierro, se observa que el modelo cuadrático resultó significativo para un nivel de confianza del
95.0%. De acuerdo a los resultados, existió una relación estadísticamente significativa a los
factores de concentración de etanol (A), tiempo de extracción (B) y temperatura de extracción
(C).
El R2 indicó que el modelo ajustado explica el 97.82% de la variabilidad en la capacidad
antioxidante. En función a los coeficientes, se observa que el término concentración de etanol
(102.32) y temperatura de extracción (24.92) tuvieron mayor influencia sobre el modelo de
capacidad antioxidante, seguido del tiempo de extracción (17.49). El signo positivo de los
coeficientes que se muestra la Tabla 4, indica que al aumentar la concentración de etanol (A),
tiempo de extracción (B) y temperatura de extracción (C), aumenta la capacidad antioxidante
reductora del hierro y viceversa. La influencia de estos factores sobre la capacidad antioxidante
se observa en la figura 2.
De las 6 soluciones optimizadas propuestas para el proceso de extracción hidroalcohólica de
las hojas de cedrón, se seleccionó la de mayor conveniencia estadística (0.995), con una
concentración de etanol del 90% v/v, tiempo de extracción de 24 horas y temperatura de
extracción de 60°C, que correspondió con un contenido de polifenoles totales de 101.24 mg/g
y capacidad antioxidante de 916.92 µM Fe 2+/g.
Rojas J., Trávez, A., Cevallos E., Maldonado N.
67
Figura 2. Influencia de la concentración de etanol (A), tiempo de extracción (B) y
temperatura de extracción (C) en la capacidad antioxidante reductor del hierro (µM Fe 2+/g
muestra) del extracto hidroalcohólico de cedrón.
3.3 Caracterización del extracto hidroalcohólico optimizado
Para comprobar la validez de la optimización del diseño, se replicó el experimento a las
condiciones de concentración de etanol del 90% v/v, tiempo de extracción de 24 horas y
temperatura de extracción de 60°C. En la Tabla 5, se observa que el extracto presentó valores
de polifenoles totales y capacidad antioxidante, similares a los obtenidos a través de la
optimización numérica, lo que confirmó la validez de los modelos obtenidos para el proceso
de extracción. Además, se caracterizó el extracto en sólidos totales, sólidos solubles, acidez
valorable, pH y turbidez.
Tabla 5. Caracterización física y química del extracto hidroalcohólico de cedrón optimizado
Parámetro
Media
Capacidad antioxidante
reductor del hierro (µM Fe2+/g
muestra)
917.23±3.03
Contenido Polifenoles totales
(mg/g)
102.13±0.3
Sólidos totales (%)
4.5 ± 0.3
Acidez (% m/m de ácido cítrico)
0.15 ± 0.02
Sólidos solubles (ºBrix)
15.2 ± 0.4
pH
6.98 ±0.4
Fuente: Maldonado y Reinoso, 2021
4. CONCLUSIONES
Las hojas de cedrón, presentaron una mayor presencia de compuestos fenólicos y flavonoides
en los extractos acuoso y alcohólico. Además, las condiciones óptimas de extracción
correspondieron a 90% (v/v) de etanol, 24 h como tiempo de extracción y 60°C como
temperatura de extracción. El contenido de polifenoles totales de 102.13 mg/g y capacidad
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antioxidante de 917.23 µM Fe 2+/g fueron similares a los estimados mediante la optimización
numérica del proceso.
Al aumentar los factores de temperatura (ºC), concentración de etanol%(v/v) y el tiempo de
extracción (h), se incrementaron el contenido de polifenoles totales y capacidad antioxidante
de los extractos hidroalcohólicos de las hojas de cedrón.
El extracto hidroalcohólico tiene una alta capacidad antioxidante y contenido de polifenoles,
por lo que puede ser utilizado como un antioxidante natural, en formulaciones de productos
alimentarios.
5. REFERENCIAS
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