Artículo científico: Capsulas biodegradables e hidrosolubles como una alternativa de envase del contenido
seminal durante el proceso de crio-preservación de semen equino
Publicación Semestral. Vol. 1, No. 1, enero-junio 2022, Ecuador (p. 19-34)
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Publicación Semestral. Vol. 1, No. 1, enero-junio 2022, Ecuador (p. 19-34). Edición continua
CAPSULAS BIODEGRADABLES E HIDROSOLUBLES COMO UNA
ALTERNATIVA DE ENVASE DEL CONTENIDO SEMINAL DURANTE EL
PROCESO DE CRIO-PRESERVACIÓN DE SEMEN EQUINO
Juan E. Sambache Tayupanta
1
*, Juan F. Pérez Villafuerte1
1Universidad de las Américas UDLA. Vía a Nayon s/n. Campus UDLA PARK. Quito, Ecuador
*Dirección para correspondencia: juan.sambache@udla.edu.ec
Fecha de Recepción: 05-10-2021 Fecha de Aceptación: 06-12-2021 Fecha de Publicación: 31-01-2022
Resumen
El objetivo fue evaluar la utilización de cápsulas biodegradables e hidrosolubles, como una alternativa de envase
del eyaculado durante el proceso de crio-preservación de semen, se evaluó la integridad de la cápsula y las
características espermáticas post-descongelación del semen equino de 5 donantes de raza criolla. La extracción
de semen se realizó mediante vagina artificial, se analizaron características como el color, el pH, la motilidad en
masa, motilidad individual, morfología y concentración. Se realizó una dilución de 1 ml de semen con un 1 ml
del diluyente y crio-preservante. Se utilizaron dos crio-preservantes (Triladyl® y Botucrio®) para determinar el
efecto del crio-preservante sobre las características seminales post descongelación. Usando como base la técnica
de empaquetamiento de pajuelas, con la adecuación del envasado del semen en cápsulas biodegradables como
contenedor, se realizaron un total de 24 cápsulas de semen divididas en 2 tratamientos (12 cápsulas con dilución
de Triladyl® y 12 cápsulas con dilución de Botucrio®) para someterlas a condiciones de congelación en gradientes
de temperatura hasta llegar a -196 Cº. Los indicadores evaluados fueron la calidad estructural de la cápsula y las
características espermáticas post-descongelación. Se concluye que la utilizaciòn de cápsulas con polímeros
biodegradables, es una alternativa eficaz como contenedor del eyaculado durante el proceso de crio-preservación,
ya que se observa una adecuada integridad de la cápsula, sin deformación estructural, presenta un sellado
hermético, mostrando resistencia al proceso. Se observó una ligera gelatinización del polímero de la cápsula
(expansión) pero no se destruyen, lo que permite que las características seminales se mantengan intactas. La
utilización del Botucrio® muestra ser eficaz, produce tasas de motilidad individual y en masa superiores al
diluyente Triladyl®. Estas diferencias en la motilidad individual y masal de los espermatozoides, pueden ser
atribuidos a efectos inherentes a la composición de las formulaciones de los diluyentes evaluados.
Palabras Clave: Equino criollo, Cápsula biodegradable, Crio-preservación, Espermatozoide.
IDs Orcid:
Juan E. Sambache Tayupanta: https://orcid.org/0000-0002-9686-8351
Juan F. Pérez Villafuerte: https://orcid.org/0000-0002-8084-6350
Sambache, J. y Pérez, J.
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BIODEGRADABLE AND WATER-SOLUBLE CAPSULES AS AN ALTERNATIVE PACKAGING
FOR SEMEN CONTENT DURING THE EQUINE SEMEN CRYOPRESERVATION PROCESS
Abstract
The objective was to evaluate the use of biodegradable and water-soluble capsules, as an alternative for packaging
the ejaculate during the semen cryopreservation process, Were evaluated the integrity of the capsule and the post-
thaw sperm characteristics of equine semen from 5 donors Creole breed. Semen extraction was performed using
an artificial vagina, characteristics such as color, pH, mass motility, individual motility, morphology and
concentration were analyzed. Was made a dilution of 1 ml of semen with 1 ml of the extender and cryo-
preservative. Two cryopreservatives (Triladyl® and Botucrio®) were used to determine the effect of the
cryopreservative on post-thaw semen characteristics. Using the straw packaging technique as a basis, with the
adaptation of semen packaging in biodegradable capsules as a container, were made a total of 24 semen capsules,
divided into 2 treatments (12 capsules with Triladyl® dilution and 12 capsules with Triladyl® dilution).
Botucrio®) to subject them to freezing conditions in temperature gradients until reaching -196 Cº. The indicators
evaluated were the structural quality of the capsule and the post-thaw sperm characteristics. It is concluded that
the use of capsules with biodegradable polymers is an effective alternative as a container for the ejaculate during
the cryopreservation process, since an adequate integrity of the capsule is observed, without structural
deformation, it presents a hermetic seal, showing resistance to process. A slight gelatinization of the capsule
polymer (expansion) was observed but they were not destroyed, allowing the semen characteristics to remain
intact. The use of Botucrio® shows to be effective, it produces individual and mass motility rates higher than the
Triladyl® diluent. These differences in the individual and mass motility of the spermatozoa can be attributed to
effects inherent to the composition of the formulations of the diluents evaluated.
Keywords: Creole equine, Biodegradable capsule, Cryo-preservation, Espermatozoide.
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1. INTRODUCCIÓN
En términos generales, con semen congelado en equinos la fertilidad es menor en comparación
con la observada en otras especies. Este fenómeno se debe a características propias de la especie
y a que la selección del reproductor se hace de acuerdo a su rendimiento en las diferentes
disciplinas ecuestres, más no en su capacidad reproductiva. (Clulow et al., 2007). Esto ha
llevado a que los sementales sean catalogados como buenos o malos candidatos para que sus
células germinales sean sometidas a proceso de congelación, con base en las características de
su movilidad espermática pos-descongelación. (Hoffmann et al., 2007). El proceso de crio-
preservación de semen radica en la congelación y conservación de las células germinales a
descensos de temperaturas con objetivos reproductivos, siendo elemental para las prácticas de
biotecnología de la reproducción. La criobiología ha experimentado los efectos de los
descensos de temperaturas sobre las células germinales y su correlación con el tiempo de
exposición, generando el conocimiento base para realizar los procesos de crio-preservación
(Palacios, 1994). En el proceso de congelación de las células germinales se originan cambios
en la organización y estructura de las membranas plasmáticas lo que afecta a las características
seminales con tendencia a reducir su capacidad fecundante y de acuerdo a su resistencia se
definirá los rangos de supervivencia. (Jiménez, 2011).
La inseminación artificial se ha visto limitada en la especie equina debido a que la crio-
preservación del semen es uno de los principales problemas en los criadores ecuestres. Si se
realiza el análisis del costo-beneficio de los programas de inseminación artificial, no se
observan buenos resultados; esto podría deberse a la utilización de crio-preservantes para
bovinos y otros rumiantes (Giraldo, 2006), así como también, el corto tiempo de vida del
germoplasma lo que limita la aplicación de las distintas técnicas de reproducción asistida y por
tanto el progreso genético (Restrepo, 2014). El problema mundial para acelerar los programas
de mejora genética en equinos, es la adquisición de genomas deseables que contengan el
material genético para la expresión de características productivas de caballos puros que buscan
los criadores y a través de su utilización poder instaurar los programas de mejoramiento
genético enfocadas en las razas criollas (Justac, 2017).
En el Ecuador el costo de compra-venta de genética es muy alto, ya sea por el valor económico
que representa, el mérito genético del animal, carga genética o la aparición de ciertos rasgos de
Sambache, J. y Pérez, J.
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interés productivo que los criadores buscan con el objetivo de potencializar su valor (Almeida,
2012). En el país, la utilización de las técnicas de reproducción asistida en la especie equina es
limitada, concretamente no se ha realizado un programa para modificar los métodos
tradicionales de contención espermática equina e inseminación artificial. Tampoco se han
impulsado proyectos de investigación genética enfocado a rescatar el caballo criollo
ecuatoriano y darle un realce manteniendo y mejorando sus caracteres fenotípicos y genotípicos
de esta manera permitir al caballo ecuatoriano posicionarlo como una raza propia del país
(Justac, 2017).
El planteamiento de esta investigación propone cambiar el medio de envasado convencional
por un medio de envasado del semen en cápsulas biodegradables e hidrosolubles, determinar
la eficacia de la cápsula de polímeros hidrosolubles como contenedor espermático y su
resistencia al medio criogénico; de igual manera con el fin de evaluar el diluyente más
adecuado para la especie equina, se propone utilizar dos crio-persevantes; uno exclusivo para
equinos como es el Botucrio® de la empresa Botupharma USA y el Triladyl® de la empresa
Minitube un diluyente comercial muy utilizado para la crio-conservación de semen y que
muestra gran eficacia en varias especies animales.
Bajo este contexto, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la utilización de cápsulas
biodegradables e hidrosolubles como una alternativa de envase del contenido seminal durante
el proceso de crio-preservación de semen equino. También se evaluó el efecto del crio-
protector sobre los caracteres espermáticos pos descongelación del semen equino de razas
criollas con embasamiento en cápsulas biodegradables e hidrosolubles.
2. METODOLOGÍA
2.1 Unidad experimental
Para el desarrollo de la investigación, se utilizó el semen fresco de 5 equinos donantes de raza
criolla ecuatoriana con un rango de edad de 5 a 7 años de edad de propiedad de la Hacienda
Pachanlica perteneciente al cantón Pelileo en la parroquia Salasaca en la provincia de
Tungurahua, de los cuales se obtuvo una cantidad promedio de 20.6 ml de semen de cada
donante. Las muestras de semen fueron analizadas y el ensayo se desarrolló en el laboratorio
de Biotecnología de la reproducción Animal de la Universidad Técnica de Cotopaxi.
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2.2 Preparación de las cápsulas biodegradables
Se realizó la separación del almidón de yuca mediante el reposo del tubérculo en suspensión
de agua y posteriormente fue filtrada por telas finas para atrapar el almidón. Mediante
polimerización se logró obtener una estructura gelatinosa moldeable (Meneses et al., 2013), la
misma que se colocó en un molde de cerámica positivo y negativo de cápsulas y tapas de 50
unidades por período. Se desmoldo un total de 200 cápsulas viables de acuerdo a su estructura
y morfología. Después de una semana de reposo se solidifican en cápsulas semi-duras con
propiedades hidrosolubles.
2.3 Recolección del semen
La colecta del semen se realizó con la ayuda de una yegua previamente sometida a un proceso
de sincronización de celo, que ayudaría como estímulo para facilitar la monta de los sementales
donantes de la muestra. Mediante la aplicación de la técnica de vagina artificial y posterior
desviación del pene del donador, se realizó la extracción del semen. Luego del armado de la
vagina artificial equina se dispuso al semental para la recolección del semen, se esperó el reflejo
de monta del donante y se espera un lapso de 15 minutos hasta apreciar el reflejo del tercer
golpe de contracción equina en el cual el macho libera aproximadamente 20.6 ml de semen. En
el momento de la colecta, se retiró mediante un filtro estéril la fracción en gel del eyaculado
que permita la obtención de la fracción rica en espermatozoides (Varner, 2008). Todos los
materiales que se utilizaron para la extracción y procesamiento de la muestra seminal fueron
atemperados previamente a 37 grados centígrados. El eyaculado resultante producto de la
extracción fue sometido a un medio frío de 12 grados centígrados en condiciones de asepsia
que permita mantener las características seminales intactas para ser transportados al laboratorio
para su valoración y posterior procesamiento.
2.4 Valoración de la muestra obtenida
Se procedió a realizar una dilución de 1 ml de semen en 1 ml de diluyente dependiendo del
tratamiento (Triladyl® y Botucrio®) como crio-conservantes. Para la valoración de la muestra
en el laboratorio, ésta fue sometida a una temperatura de 37 grados centígrados mediante la
exposición de la muestra en baño María. En un portaobjetos se colocó 500 ul de muestra
seminal para valorar sus características macroscópicas y microscópicas previo al envasado en
Sambache, J. y Pérez, J.
24
cápsulas biodegradables y sometidas al proceso de congelación del semen. Las características
microscópicas evaluadas fueron: Motilidad en Masa, motilidad individual, morfología del
espermatozoide y concentración, como características macroscópicas se evaluó el color y el pH
de la muestra. Con la utilización de la cámara de Neubauer mediante el conteo de cuadrantes,
se realizó el cálculo para estimar el número de espermatozoides presentes en la muestra. Para
determinar la concentración espermática de la muestra se aplicó la siguiente fórmula:
𝐸𝑠𝑝.
𝑚𝑚3=𝐴𝑥𝐵𝑥𝐶𝑥𝐸
𝐹
donde:
Ax: Número de espermatozoides contados
Bx: Tamaño del cuadradito (400mm2)
Cx: Dilución Realizada 0.5 ml
D: Altura de la cámara (0.1mm)
E: Se multiplica por 10 para que el resultado quede expresado en 1mm3
F: Número de cuadraditos contados
Fuente: (OMS, 1992)
2.5 Valoración del efecto del crio-preservante utilizado, en relación a la calidad de la
muestra seminal envasada en cápsulas biodegradables
Para determinar el efecto del crio-preservante sobre la calidad seminal se prepararon 24
cápsulas de semen de las cuales 12 cápsulas contenían dilución seminal con Botucrio® y 12
cápsulas con dilución de semen con Triladyl® las mismas que fueron sometidas a procesos de
crio-preservación. Después de 42 días post congelación se realizó la valoración de los dos
diluyentes utilizados (Triladyl® y Botucrio®) para lo cual se procedió a la descongelación de
las cápsulas de semen en baño María por 60 segundos a 37°C. Mediante un procedimiento
modificado al reportado por Hidalgo22, se evaluaron los parámetros como el aspecto, el color,
pH, motilidad en masa, motilidad individual, morfología y concentración. Se empleó un
microscopio de contraste de fase con la adaptación de una Tablet con una cámara digital para
facilitar su visualización. Para la valoración de la morfología y motilidad espermática se
establecieron mediante la técnica modificada de eosina-nigrosina (Brito et al., 2011). En un
portaobjetos atemperado a 37°C, se colocó una gota de semen con una gota de eosina-nigrosina;
las gotas se fusionaron durante 30 a 60 segundos, y se realizó un extendido y la fijación del
mismo con calor sobre una platina térmica. Se observó la morfología individual de los
espermatozoides mediante microscopía (1000X). Los espermatozoides fueron clasificados
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como morfológicamente normales o anormales (Brito et al., 2011). De igual manera, se
clasificaron como vivos aquellos espermatozoides que no incorporaron el colorante y como
muertos, aquellos que incorporaron el colorante.
2.6 Análisis estadístico
Mediante un modelo lineal generalizado (GLM) para cada variable dependiente como el pH,
motilidad en masa, motilidad individual, morfología y concentración. Todas las variables a
excepción de la variable dependiente, fueron incluidas en cada modelo como covariables. A
continuación, se describe el modelo general empleado:
Yijklmnopqr = µ + Ei + Tj + Rk+ Clmnopqr +eijklmnopqr
donde:
Yijklmnopqr pH, motilidad en masa, motilidad individual, morfología y concentración del
eyaculado del equino i, bajo el tratamiento j, en la repetición k, bajo las covariables l, m, n, o,
p, q, r.
µ: Media para la característica.
Ei: Efecto fijo del eyaculado del equino (i).
Tj: Efecto fijo del tratamiento (j). (j= Triladyl® y Botucrio®).
Rk: Efecto fijo de la repetición (k). (k=1…4).
Clmnopqr: Efecto fijo de las covariables (l, m, n, o, p, q, r).
eijklmnopqr: Error aleatorio.
Los resultados de cada tratamiento se compararon con la prueba de Tukey al 5%. Para
determinar la asociación entre las variables evaluadas, se realizó un análisis de correlación de
Pearson. Para todas las evaluaciones se utilizó el programa SAS 9.2.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Luego de instaurar el experimento se procedió a evaluar la integridad de la cápsula como medio
de envase del contenido seminal y su resistencia durante el proceso de crio-preservación.
También se valoró los crio-preservantes Botucrio® y Triladyl® como medios de dilución y
crio-protectores para el semen equino y su efecto sobre las características seminales con la
adecuación del medio de contención en capsulas biodegradables. Con el fin de determinar la
Sambache, J. y Pérez, J.
26
integridad y la viabilidad de la muestra seminal en la post-descongelación, se realizó la
valoración de la muestra a los 42 días. Transcurrido el periodo de tiempo señalado se procedió
a descongelar un número de 24 cápsulas para su valoración las mismas que fueron colocadas
en tubos contenedores y sometidos a baño María para alcanzar una temperatura de 37 grados
centígrados. A la muestra se le añadió 0.5 ml de diluyente (BotuTurbo®) con el fin de simular
las condiciones vaginales finalmente el contenido seminal se extrajo mediante una pipeta. A
través de microscopía se evaluaron las características microscópicas y con la utilización de la
cámara Neubauer se realizó conteo y cálculo para la estimación del número de espermatozoides
presentes en la muestra.
3.1 Evaluación del semen pre-congelación
Previo al proceso de crio preservación del semen se realizó la valoración de la muestra, la
misma que presentó un aspecto acuoso propio del semen con un color blanco grisáceo, con un
pH promedio de 6,9 el mismo que según Gómez (2013), debería estar en un promedio de 7.2 a
7.6. Mediante microscopía, en la muestra se observó una buena motilidad en masa (89.52%),
una motilidad individual que presenta un 87.20% que representa un vigor de 5, en cuanto a la
estructura del espermatozoide presentó una morfología del 89.52% considerada como normal
(>80%) con una concentración de 800x106 Epz Mm3, Tabla 1.
Tabla 1. Valoración pre congelación del semen
Parámetro
Valoración
Aspecto
Acuoso
Color
Blanco Grisáceo
pH
6.9
Motilidad En Masa
89.52 = Muy Buena ( 80% – 90% Cmm)
Motilidad Individual
87.20 = Vigor 5 (MPRMR)
Morfología
89.52 = Normal >80%
Concentración
800x106 Epz Mm3
*Se muestran las variables y sus valores de acuerdo a las medidas expresadas.
3.2 Envasado del pellet espermático en cápsulas biodegradables
Posterior a la valoración previa de las características macroscópica y microscópica del semen,
se procedió a concentrar la carga espermática mediante centrifugación a 300 g por minuto
durante ciclos de 2 minutos, con el objetivo de obtener el sedimento o pellet que constituye la
fracción rica en espermatozoides. Finalizado el proceso de centrifugado se procedió a tomar la
muestra sedimentada para llenar las cápsulas biodegradables en alícuotas de 0.65 ml de semen
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y colocarlas en tubos de contención, los mismos que fueron expuestos en distintos gradientes
de disminución de temperatura para adecuarlas a la temperatura de crio-preservación. Las
cápsulas llenas de semen se sometieron a vapores de nitrógeno líquido por 15 min y a 6 cm de
la superficie. Luego fueron sumergidas en nitrógeno líquido por 20 segundos. Una vez
expuestas las cápsulas de semen a la temperatura de -196°C estas fueron colocadas en el tanque
de nitrógeno líquido para su preservación.
3.3 Evaluación capsular pre-congelación
Las cápsulas elaboradas del almidón de yuca se adecuaron como contenedores llenos de semen,
simulando el principio de una cápsula farmacéutica normal. Durante el proceso de
empaquetamiento seminal las cápsulas presentaron una estructura uniforme y un sellado
hermético, también se observó una ligera dilatación de la cápsula modificando su forma, pero
sin descomponerse ni destruirse, estas características son ideales y son las que deben presentar
los contenedores en la industria farmacéutica. Según Ceballos y De la Cruz (2007), este proceso
se lo conoce como gelatinización del polímero en la cual sus moléculas se expanden, pero no
se destruyen.
3.4 Evaluación capsular post-descongelación
Al retirar las cápsulas del medio de crio-preservación a los 42 días, se observó que las cápsulas
habían sufrido un cambio en su forma semejante al proceso de deshidratación de una uva, pero
sin perder su propiedad estructural y manteniendo las características de su composición y
sellado hermético lo que permite que el contenido seminal se mantenga intacto, en perfecto
estado de congelación, sin observar fugas en la cápsula y sin perder su capacidad aislante.
El estudio de modificaciones en el uso de nuevos contenedores seminales durante el proceso
de empaquetado de semen equino propone una apertura para el desarrollo de la biotecnología
de la reproducción enfocada en nuevas técnicas y procesos de la inseminación artificial en
equinos, la misma que concuerda con lo propuesto por (Mesa, 2015), quien sostiene que la
reproducción con semen congelado es una alternativa viable dependiendo de la técnica y el
proceso de preparado del semen. El empaquetado de semen en cápsulas biodegradables e
hidrosolubles dio un margen alto de viabilidad e integridad de la cápsula, pese al riesgo de
ruptura que se esperaba de la misma, la cual no sufrió daños estructurales en la crio-
Sambache, J. y Pérez, J.
28
preservación y manteniendo intacto su contenido. (Jiménez, 2011), sostiene que la técnica
tradicional de empaquetado de semen en pajuelas de 0.5 ml es la opción más recomendable
debido a su fácil producción y transporte. No obstante la cápsula propuesta es de más fácil
producción y de similar viabilidad lo que comprueba que la inclusión en nuevas técnicas o
modificaciones de envasado puede dar como origen a nuevas ramas y aplicaciones
reproductivas al alterar factores primordiales como la técnica de inseminación artificial
tradicional y proponiendo incluso, protocolos inseminación artificial a tiempo fijo (IATF) para
futuras investigaciones en equinos o en diferentes especies, acotando a lo mencionado se puede
aplicar dicha propuesta a diferentes especies manteniendo su estructura inicial y cambiando los
métodos tradicionales de contenedores de semen durante el proceso de crio-preservación.
3.5 Valoración del efecto del crio-preservante utilizado en relación a la calidad de la
muestra
Se halló un volumen de semen promedio (mL) de 20.6 ± 5.4 de los eyaculados recolectados de
cada donante. Se evaluaron post-descongelación 24 cápsulas de semen en total. Los resultados
de los modelos ajustados para los diferentes parámetros espermáticos evaluados se presentan
en la tabla 2. Donde se observa que las muestras post-descongelación muestran un promedio
del pH de 7.05, presentan una motilidad masal de 84.43%, con una motilidad individual de
76.66%, una morfología dentro de los rangos de normalidad ya que se observa que más del
80% de espermatozoides muestran integridad en la morfología espermática (82.34%) y una
concentración de espermatozoides promedio 1000x106 Epz Mm3 163. ± 163.6
Tabla 2. Resultados de los modelos ajustados para los parámetros espermáticos
Variable
Media
Coeficiente de
variación
R2
pH.
7.05
0.15
0.95
Motilidad Masal
84.43
3.56
0.82
Motilidad Individual
76.66
12.33
0.97
Morfología
82.34
3.58
0.91
Concentración
1000x106
22.75
0.88
*R2: Coeficiente de determinación del modelo ajustado. T: tratamiento. M.M: motilidad en
masa. M.I: motilidad individual. M: morfología. C.T: concentración
En la tabla 3 se observan los resultados de la evaluación del semen fresco y su comparación de
las muestras seminales crio-preservadas en cápsulas biodegradables para valorar el efecto de
los dos crio-preservante utilizados en los tratamientos realizados. Al comparar el efecto de los
dos diluyentes utilizados se puede observar que el Botucrio® como medio protector del semen
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muestra diferencias significativas al comparar el efecto protector del diluyente Triladyl®, se
puede observar una favorable supervivencia y resistencia espermática, donde la estructura del
contenido seminal se mantuvo estable ya que el diluyente Botucrio® preservó la muestra
seminal del choque térmico donde se observó una viabilidad prolongada del semen con un pH
estable (7) a diferencia del tratamiento con Triladyl®, donde se observa un pH con tendencia
al medio ácido (7.8). De igual manera se observó una menor capacidad de la motilidad tanto
masal como individual a diferencia de las muestras crio-preservadas con el Botucrio® donde
los rangos de motilidad son superiores, un efecto de superioridad numérica pero no estadística
se observa al valorar la morfología donde se identificó un menor daño en la estructura del
espermatozoide donde la acción del Botucrio® por su combinación de dos crio-protectores
permite incrementar la supervivencia del espermatozoide manteniendo la muestra seminal en
condiciones de estabilidad en comparación con los diluyentes que contienen glicerol
(Triladyl®). Debido al proceso de centrifugación, al que fueron sometidos para su
concentración, el color del eyaculado presenta una ligera variación por presencia del diluyente
en la muestra, al valorar la concentración se observa un aumentó con relación a los valores
iniciales (semen fresco). Este incremento se registra por consecuencia del proceso de
centrifugado al que fue sometido el eyaculado antes del proceso de empaquetamiento en
cápsulas biodegradables y cuyo objetivo fue para formar el pellet espermático, este
comportamiento se mantiene en los dos tratamientos lo que determina que no existe efecto del
crio-preservante sobre la concentración y que no existió sesgo en la investigación ya que la
cantidad de espermatozoides en la muestra fue equitativa para los dos tratamientos.
La disminución de la calidad seminal post-descongelación en relación al semen fresco ha sido
descrita ampliamente en equinos por Salazar (2011). En los resultados de esta investigación se
observa una reducción significativa al comparar el semen fresco con las muestras sometidas al
proceso de crio-conservación en los caracteres espermáticos como la motilidad en masa, la
motilidad individual y la morfología (Tabla 3). También se observan diferencias significativas
al comparar el efecto de los dos diluyentes utilizados del Botucrio® y Triladyl® sobre las
características antes mencionadas. No se observó efecto significativo de la crio preservación
sobre la morfología y la concentración; sin embargo, autores como Brum (2008), han reportado
diversas alteraciones de la morfología de espermatozoides equinos crio-preservados. Los
Sambache, J. y Pérez, J.
30
promedios encontrados de motilidad de semen fresco y crio-preservado en esta investigación
son comparables a otros reportados por Lozano (2016), cuando realizó una evaluación similar
de estas características con un sistema CASA.
Tabla 3. Resultados de la evaluación del semen fresco y semen crio preservado en relación a
los tratamientos utilizados
Tratamiento
pH.
Motilidad En
Masa
Motilidad
Individual
Morfología
Concentración
Semen Fresco
6.9a
89.52 a
82.70 a
89.52 a
800x106 a
Triladyl®
7.8b
77.87 b
72.80 b
77.23 b
1000x106 b
Botucrio®
7.0a
85.99 a
81.97 a
81.42 b
1000x106 b
*Letras diferentes denotan diferencia estadística (P≤0.05).
Figura 1. Evaluación de las características seminales: Motilidad en masa (M.,M); Motilidad
Individual (M.I); Morfología (M) en semen fresco y semen congelado en relación al crio-
preservante utilizado
El porcentaje de motilidad en masa post-descongelación fue superior para el diluyente
Botucrio®, respecto al diluyente Triladyl®, el mismo comportamiento se observó para la
variable motilidad individual (Tabla 3). Aunque estos diluyentes se han utilizado de forma
frecuente en procesos de investigación, son escasos los antecedentes de comparación de los
mismos para la crio-preservación de semen equino. Los crio-protectores constituyentes de los
diluyentes empleados podrían, en parte, explicar los resultados obtenidos, teniendo en cuenta
la composición del Botucrio® y la formulación original del Triladyl® con glicerol. El
Botucrio® como medio diluyente para la congelación de semen equino que combina glicerol-
6.9
89.52 82.7 89.52
7.8
77.87 72.8 77.23
7
85.99 87.97 81.42
pH. M.M M.I M
Semen Fresco Triladyl® Botucrio®
Recursos Naturales Producción y Sostenibilidad
Artículo científico: Capsulas biodegradables e hidrosolubles como una alternativa de envase del contenido
seminal durante el proceso de crio-preservación de semen equino
Publicación Semestral. Vol. 1, No. 1, enero-junio 2022, Ecuador (p. 19-34)
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metilformamida como crio-protector y 20 aminoácidos diferentes permitió determinar en la
evaluación in vitro del semen congelado con Botucrio®, una favorable supervivencia y
resistencia espermática, donde la estructura del contenido seminal se mantuvo estable, el
diluyente preservó la muestra seminal del choque térmico ya que al valorar las características
microscópicas se observó una viabilidad prolongada, motilidad espermática adecuada,
extendiendo el tiempo de vida de los espermatozoides y con ciertas variante al estabilizar las
muestras dentro de un pH de 7. Esta valoración concuerda con lo antes descrito por Samper6
donde atribuyen a la acción del Botucrio® por su combinación de dos crio-protectores, lo que
permite que se incremente la supervivencia del espermatozoide en comparación con los
diluyentes que contienen glicerol como único crio-protector por lo que se atribuye al efecto de
la composición propia del Triladyl® las diferencias observadas en las variables analizadas. Sin
embargo, hay que señalar que el crio-protector Triladyl® está recomendado y con excelentes
resultados para la especie bovina y otros rumiantes lo que podría ser determinante en los
resultados obtenidos.
También se observó una interesante asociación entre la motilidad en masa e individual y lo
cual denota el papel determinante de la funcionalidad de la membrana plasmática en la
capacidad de movimiento de los espermatozoides equinos, como lo describió Salazar (2011),
que encontraron una correlación de r=0.86 entre la motilidad progresiva individual y en masa.
(Mesa P., 2015) y sus colaboradores igualmente observaron superioridad de los crio-
persevantes compuestos por más de un protector dentro de su composición, en comparación de
los crio-protectores que contiene glicerol como único protector al valorar la movilidad del
semen equino crio-preservado. Este estudio es importante y relativo para esta investigación,
dado que para el estudio se tuvo en cuenta la inclusión de los mismos crio-protectores, donde
se empleó el sistema SCA® para la evaluación de la motilidad del semen de caballos de la raza
criollo colombiano, lo que corrobora los resultados obtenidos en esta investigación. No se
observó ningún efecto significativo en la post-descongelación de los diluyentes utilizados sobre
las características como la morfología y la concentración espermática (Tabla 3). Sería
recomendable entonces evaluar el efecto de estos diluyentes sobre otras estructuras celulares y
sobre diferentes procesos metabólicos del semen.
Sambache, J. y Pérez, J.
32
4. CONCLUSIONES
Luego de la investigación, se determina que la utilización de cápsulas de almidón de yuca con
polímeros biodegradables, es una alternativa de contenedor del eyaculado durante el proceso
de empaquetamiento y crio-preservación seminal, ya que se observa una adecuada integridad
de la cápsula, sin deformación estructural, presenta un sellado hermético y muestra resistencia
a las condiciones crio-génicas, también se observó una ligera gelatinización del polímero en la
cual sus moléculas se expanden pero no se destruyen, lo que permite que las características
seminales se mantengan intactas.
La estructura morfológica de la cápsula se mantuvo estable en condiciones de crio-
preservación a temperaturas de -196ºC durante las seis semanas de duración del experimento,
lo que permite corroborar que los polímeros biodegradables son contenedores aceptables, ya
que aseguran el aislamiento y la inocuidad del contenido interno de la cápsula; por lo tanto se
convierte en una alternativa viable como contenedor de semen equino, ya que permite mantener
intactas las características macroscópicas y microscópicas del semen diluido dentro de
parámetros aceptables y sin perder la capacidad fecundante del semen.
La utilización del Botucrio® como diluyente y crio-preservante, muestra ser eficaz, ya que
produce tasas de motilidad individual y en masa superiores al observado con el diluyente
Triladyl® en el semen descongelado de caballos de las razas criollas ecuatorianas. Estas
diferencias en los indicadores de la motilidad individual y masal de los espermatozoides,
pueden ser atribuidos a efectos inherentes de la composición de cada una de las formulaciones
de los diluyentes utilizados y evaluados en esta investigación.
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